樓主! 實(shí)驗(yàn)八 培養(yǎng)基制備與滅菌 、目要求1. 掌握微物實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿清洗及包扎.2. 掌握培養(yǎng)基配置.3. 掌握干熱滅菌高壓蒸汽滅菌操作.二、基本原理 確掌握培養(yǎng)基配制事微物實(shí)驗(yàn)工作重要基礎(chǔ).由于微物種類及代謝類型性．用于培養(yǎng)微物培養(yǎng)基種類,配及配制雖各差異.般培養(yǎng)基配制程序卻致相同．例器皿準(zhǔn)備,培養(yǎng)基配制與裝,棉塞制作,培養(yǎng)基滅菌,斜面與平板制作及培養(yǎng)基菌檢查等基本環(huán)節(jié)致相同.三、實(shí)驗(yàn)材料1. 藥品：待配各種培養(yǎng)基組、瓊脂、1mol/LNaOHHCl溶液.2. 儀器及玻璃器皿：平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等.3. 其物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等.四、操作步驟（）玻璃器皿洗滌包裝1．玻璃器皿洗滌玻璃器皿使用前必須洗刷干凈.三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含洗滌劑水．用毛刷刷洗,用自水及蒸餾水沖凈.移液管先用含洗滌劑水浸泡,再用自水及蒸餾水沖洗.洗刷干凈玻璃器皿置于烘箱烘干備用.2．滅菌前玻璃器皿包裝（1） 培養(yǎng)皿包扎：培養(yǎng)皿由蓋底組套,用報(bào)紙幾套培養(yǎng)皿包包,或者幾套培養(yǎng)皿直接置于特制鐵皮圓筒內(nèi),加蓋滅菌.包裝培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌才能使用.（2） 圖8-1 移液管包扎移液管包扎：移液管端塞入段棉花(勿用脫脂棉),作用避免外界及口雜菌進(jìn)入管內(nèi),并防止菌液等吸入口.塞入段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右,棉花自身度約1~1.5cm.塞棉花．用外圍拉直曲別針、少許棉花塞入管口內(nèi).棉花要塞松緊適宜,吹能通氣使棉花滑準(zhǔn).先報(bào)紙裁寬約5cm左右紙條,已塞棉花移液管尖端放條報(bào)紙端,約45℃角,折疊紙條包住尖端,用左手握住移液管身,手移液管壓緊．桌面向前搓轉(zhuǎn),螺旋式包扎起.端剩余紙條,折疊打結(jié),準(zhǔn)備滅菌.（二）液體及固體培養(yǎng)基配制程1．液體培養(yǎng)基配制1) 稱量：般用0.01g平稱量配制培養(yǎng)基所需各種藥品,先按培養(yǎng)基配計(jì)算各用量．進(jìn)行準(zhǔn)確稱量.2) 溶稱藥品置于燒杯,先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用自水或蒸餾水),用玻璃棒攪,加熱溶解.3) 定容：待全部藥品溶解,倒入量筒,加水至所需體積.某種藥品用量太少,預(yù)先配較濃溶液,按比例吸取定體積溶液,加入至培養(yǎng)基.4) 調(diào)pH：般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基pH.用剪刀剪段pH試紙,用鑷夾取段pH試紙,培養(yǎng)基蘸,觀看其pH范圍,培養(yǎng)基偏酸或偏堿,用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié).調(diào)節(jié)pH,應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液,防止局部酸或堿,破壞培養(yǎng)基.邊加邊攪拌,并用pH試紙測(cè)試,直至達(dá)所需pH止.5) 濾：用濾紙或?qū)蛹啿紴V培養(yǎng)基.般特殊要求,步省.2．固體培養(yǎng)基配制 配制固體培養(yǎng)基,應(yīng)已配液體培養(yǎng)基加熱煮沸,再稱瓊脂(1.5~2％)加入,并用玻棒斷攪拌,免糊底燒焦.繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化,補(bǔ)足蒸發(fā)失水.（三）培養(yǎng)基裝 根據(jù)同需要,已配培養(yǎng)基裝入試管或三角瓶?jī)?nèi),裝注意要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口,造污染.操作,培養(yǎng)基沾污管口或瓶口,用鑷夾塊脫脂棉,擦管口或瓶口培養(yǎng)基,并脫脂棉棄.1．試管裝取玻璃漏斗,裝鐵架,漏斗連根橡皮管,橡皮管端再與另玻璃管相接,橡皮管部加彈簧夾.裝,用左手拿住空試管部,并漏斗玻璃管嘴插入試管內(nèi),右手拇指及食指放彈簧夾,指及名指夾佐玻璃管嘴,使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi).裝入試管培養(yǎng)基量視試管及需要定,若所用試管15×150 mm,液體培養(yǎng)基裝至試管高度1／4左宜；裝固體或半固體培養(yǎng)基,瓊脂完全融化,應(yīng)趁熱裝于試管.用于制作斜面固體培養(yǎng)基裝量管高1／5(約3—4mI),半固體培養(yǎng)基裝量管高1／3宜.2．三角瓶裝圖8-2培養(yǎng)基裝 用于振蕩培養(yǎng)微物,250 m1三角瓶加入50 m1液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用,250 m1三角瓶加入150ml培養(yǎng)基,再加入3g瓊脂粉(按2％計(jì)算),滅菌瓶瓊脂粉同融化.（四）棉塞制作及試管、三角瓶包扎 培養(yǎng)氣性微物,需提供優(yōu)良通氣條件,同防止雜菌污染,則必須通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行濾除菌.通試管及三角瓶口加棉花塞等.1．試管棉塞制作制棉塞,應(yīng)選用、厚薄適普通棉花塊,鋪展于左手拇指食指扣團(tuán)孔,用右手食指棉花央壓入團(tuán)孔制棉塞．直接壓入試管或三角瓶口.借用玻璃棒塞入,用折疊卷塞制作棉塞.制作棉塞應(yīng)緊貼管壁,留縫隙,防外界微物沿縫隙侵入,棉塞宜緊或松,塞手提棉塞,試管落準(zhǔn).棉塞2／3試管內(nèi),1／3試管外.目前采用硅膠塞代替棉塞直接蓋試管口.裝培養(yǎng)基并塞棉塞或硅膠塞試管捆捆,外面包層牛皮紙.用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱及配制期,滅菌待用. 圖8-3 棉塞制作圖8-4 確與確棉塞1.金屬塞 2確 3、4確 2．三角瓶棉塞制作通棉塞外包層紗布,再塞瓶口.進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加通氣量,則用8層紗布代替棉塞包瓶口,目前采用硅膠塞直接蓋瓶口.裝培養(yǎng)基并塞棉塞或包扎八層紗布或蓋硅膠塞三角瓶口,再包層牛皮紙并用線繩捆,滅菌待用.（五）培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基經(jīng)裝包扎,應(yīng)立即按配制規(guī)定滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌.（六）斜面平板制作1．斜面制作已滅菌裝瓊脂培養(yǎng)基試管,趁熱置于木棒或玻棒,使適斜度,凝固即斜面.斜面度超試管度l／2宜.制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基,滅菌則應(yīng)垂直放置至凝固.2．平板制作裝三角瓶或試管已滅菌瓊脂培養(yǎng)基融化,待冷至50℃左右傾入菌培養(yǎng)皿.溫度高,皿蓋冷凝水太；溫度低于50℃,培養(yǎng)基易于凝固制作平板.平板制作應(yīng)火旁進(jìn)行,左手拿培養(yǎng)皿,右手拿三角瓶底部或試管,左手同用指手掌棉塞打,灼燒瓶口,用左手拇指培養(yǎng)皿蓋打縫,至瓶口伸入,傾入10~15mL培養(yǎng)基,迅速蓋皿蓋,置于桌,輕輕旋轉(zhuǎn)平皿,使培養(yǎng)基均勻布于整平皿,冷凝即平板.（七）培養(yǎng)基滅菌檢查滅菌培養(yǎng)基,般需進(jìn)行菌檢查.取1~2管(瓶),置于37℃溫箱培養(yǎng)1~2,確定菌使用.（八）菌水制備每250mL三角瓶?jī)?nèi)裝100mL蒸餾水并塞棉塞或硅膠塞.每支試管內(nèi)裝4.5mL蒸餾水,塞棉塞或硅膠塞.再棉塞包張牛皮紙,高壓蒸汽滅菌.0.1MPa滅菌20~30min.五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 根據(jù)要求清洗各種玻璃器皿,并進(jìn)行包扎.2. 根據(jù)要求配制各種培養(yǎng)基.3. 用電熱鼓風(fēng)干燥箱玻璃器皿進(jìn)行干熱滅菌.4. 用高壓蒸汽滅菌鍋所配各培養(yǎng)基滅菌.六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 簡(jiǎn)述移液管培養(yǎng)皿包扎注意事項(xiàng).2. 簡(jiǎn)述配制培養(yǎng)基基本步驟及注意事項(xiàng).3. 微物實(shí)驗(yàn)室所用移液管口或滴管口端均需塞入段棉花,再用報(bào)紙包起,經(jīng)高壓蒸汽滅菌才能使用?4. 微物實(shí)驗(yàn)室所用三角瓶口或試管口都要塞棉塞（硅膠塞）才能使用?5. 配制培養(yǎng)基要調(diào)節(jié)pH?6. 高壓蒸汽滅菌比干熱滅菌要求溫度低、間短? 附錄 滅菌技術(shù)、目要求解消毒滅菌原理,并掌握各種滅菌操作步驟.二、實(shí)驗(yàn)材料1. 儀器或其用具：述包扎培養(yǎng)皿、試管、移液管等,電熱鼓風(fēng)干燥箱,高壓蒸汽滅菌鍋,微孔濾膜濾器,0.22μm濾膜,注射器,鑷,玻璃涂棒.2. 培養(yǎng)基：述配制培養(yǎng)基及理鹽水三、基本原理微物實(shí)驗(yàn),需要進(jìn)行純培養(yǎng),能任何雜菌污染,必須所用器材、培養(yǎng)基工作場(chǎng)所進(jìn)行滅菌消毒.滅菌指殺死定環(huán)境所微物,包括微物營(yíng)養(yǎng)體、芽孢孢.實(shí)驗(yàn)室用滅菌包括直接灼燒、恒溫干燥箱滅菌、高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸滅菌等.些基本原理通加熱使微物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性,達(dá)滅菌目.四、操作步驟（）干熱滅菌干熱滅菌電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160℃~170℃）進(jìn)行滅菌,利用高溫使微物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性達(dá)滅菌目.適用于玻璃器皿移液管、試管培養(yǎng)皿滅菌.培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品能采用干熱滅菌.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固性與其本身含水量關(guān),菌體受熱,環(huán)境細(xì)胞內(nèi)含水量越,則蛋白質(zhì)凝固越快,反含水量越,凝固越慢.,與濕熱滅菌相比,干熱滅菌所需溫度高（160℃~170℃）,間（1~2h）.干熱滅菌溫度能超180℃,否則,包器皿紙或棉塞燒焦,甚至引起燃燒.干熱滅菌使用電熱干燥箱（干燥箱）.具體操作步驟：1. 裝入待滅菌物品：包待滅菌物品放入電熱干燥箱內(nèi),關(guān)箱門.堆積要留空隙,物品要擺放太擠,免妨礙空氣流通,滅菌物品要接觸電熱干燥箱內(nèi)壁鐵板、溫度探,防包裝紙烤焦起火.2. 升溫：接通電源,打關(guān),適打電熱干燥箱頂部排氣孔,旋恒溫調(diào)節(jié)器,使溫度逐步升.溫度升至100℃,關(guān)閉排氣孔.升溫程,紅燈熄滅,綠燈亮,表示電熱干燥箱內(nèi)停止加溫,未達(dá)所需160℃~170℃,則需要轉(zhuǎn)溫度調(diào)節(jié)器使紅燈亮,反復(fù)調(diào)節(jié),直至達(dá)所需溫度.3. 恒溫：溫度升160℃~170℃,借助恒溫調(diào)節(jié)器自控制,保持溫度2h.干熱滅菌程,嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)自控制失靈造安全事故.4. 降溫：切斷電源,自降溫.5. 箱取物：待電熱干燥箱內(nèi)溫度降60℃,才能打箱門,取滅菌物品.同,應(yīng)溫度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)零點(diǎn),并打排氣孔.電熱干燥箱內(nèi)溫度未降60℃前,切勿自行打箱門,免驟降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂.（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌物品放密閉高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),定壓力保持15~30鐘進(jìn)行滅菌.適用于培養(yǎng)基、菌水、工作服等物品滅菌,用于玻璃器皿滅菌.待滅菌物品放密閉加壓滅菌鍋內(nèi),通加熱,使滅菌鍋夾套間水沸騰產(chǎn)蒸汽.待水蒸汽急劇鍋內(nèi)冷空氣排氣閥排盡,關(guān)閉排氣閥,繼續(xù)加熱,由于蒸汽能溢,增加滅菌鍋內(nèi)壓力,使沸點(diǎn)增高,獲高于100℃溫度,導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性達(dá)滅菌目.相同溫度,濕熱滅菌效于干熱滅菌.三點(diǎn)原：濕熱滅菌菌體吸收水,蛋白質(zhì)容易凝固變性,蛋白質(zhì)隨著含水量增加,所需凝固溫度降低；濕熱滅菌蒸汽穿透力比干燥空氣；蒸汽滅菌物體表面凝結(jié),釋放量汽化潛熱,能迅速提高滅菌物體表面溫度,增加滅菌效力.實(shí)驗(yàn)室用滅菌鍋非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋?zhàn)钥厥綔缇?其結(jié)構(gòu)工作原理相同.本實(shí)驗(yàn)介紹非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋,自控式滅菌鍋使用參考廠家說(shuō)明書(shū).具體操作步驟：1. 加水：首先內(nèi)層鍋取,再向外層鍋內(nèi)加入適量水,使水面沒(méi)加熱蛇管,與三角擱架相平宜.切勿忘記檢查水位,加水量少,滅菌鍋發(fā)燒干引起炸裂事故.2. 裝料：放內(nèi)層鍋,并裝入待滅菌物品.注意要裝太擠,免妨礙蒸汽流通影響滅菌效.裝培養(yǎng)基容器放置要防止液體溢,三角瓶與試管口端均要與桶壁接觸,免冷凝水淋濕包扎紙透入棉塞.3. 加蓋：蓋與排氣孔相連排氣軟管插入內(nèi)層鍋排氣槽內(nèi),擺鍋蓋,齊螺口,稱式同旋緊相兩螺栓,使螺栓松緊致,勿使漏氣,并打排氣閥.4. 排氣：打電源加熱滅菌鍋,水煮沸,使鍋內(nèi)冷空氣水蒸汽起排氣孔排.般認(rèn)排氣流強(qiáng)并噓聲,表明鍋內(nèi)空氣已排盡,沸騰約需5鐘.5. 升壓：冷空氣完全排盡,關(guān)閉排氣閥,繼續(xù)加熱,鍋內(nèi)壓力始升.6. 保壓：壓力表指針達(dá)所需壓力,控制電源,始計(jì)并維持壓力至所需間.本實(shí)驗(yàn)采用0.1Mpa,121.5℃,20鐘滅菌.滅菌主要素溫度壓力,鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡,才能關(guān)閉排氣閥,維持所需壓力.7. 降壓：達(dá)滅菌所需間,切斷電源,讓滅菌鍋溫度自降,壓力表壓力降至0,打排氣閥,排盡余蒸汽,旋松螺栓,打鍋蓋,取滅菌物品,倒掉鍋內(nèi)剩水.壓力定要降0,才能打排氣閥,蓋取物.否則鍋內(nèi)壓力突降,使容器內(nèi)培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力平衡沖容器口,造瓶口污染,甚至灼傷操作者.8. 菌檢查：已滅菌培養(yǎng)基放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,檢查雜菌,即使用. （三）濾除菌些物質(zhì),抗素、血清、維素、糖溶液等采用加熱滅菌,容易受熱解破壞,要采用濾除菌.濾除菌通機(jī)械作用濾液體或氣體細(xì)菌,該優(yōu)點(diǎn)破壞溶液各種物質(zhì)化.濾除菌除實(shí)驗(yàn)室用于溶液、試劑除菌外,微物工作使用凈化工作臺(tái)根據(jù)濾除菌原理設(shè)計(jì),根據(jù)同需要選用同濾器濾板材料.應(yīng)用廣泛濾器種類：1. 微孔濾膜濾器：種新型濾器,由二別具口入口連接裝置塑料盒組,口處連接針,入口處連接針筒,使用濾膜裝入兩塑料盒間,旋緊盒蓋,溶液針筒注入濾器,各種微物阻留微孔濾膜面,液體物質(zhì)通濾膜,達(dá)除菌目.其濾膜由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制薄膜,孔徑同種規(guī)格（0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等）,實(shí)驗(yàn)室用于除菌微孔濾膜孔徑般0.22μm.根據(jù)待除菌溶液量少,選用同濾器.該濾器優(yōu)點(diǎn)吸附性,即溶液物質(zhì)損耗少,濾速度快,每張濾膜使用1,用清洗.2. 蔡氏（Seitz）濾器：種金屬制濾漏斗,其濾部種用石棉纖維其填充物壓制片狀結(jié)構(gòu).溶液細(xì)菌通石棉纖維吸附濾除,溶液其物質(zhì)吸附性,每張纖維板能使用1.3. 玻璃濾器：種玻璃制濾漏斗,其濾部由細(xì)玻璃粉燒結(jié)板狀構(gòu)造.玻璃濾器規(guī)格,5號(hào)（孔徑2~5μm）6號(hào)（孔徑
備注：數(shù)據(jù)僅供參考，不作為投資依據(jù)。